Wie Sie einen hängenden Tropfen vorbereiten

July 19

Um die 3D Struktur eines Proteins zu bestimmen, benötigen Sie zunächst einen reinen Kristall davon. Die hängenden-Drop-Methode verwendet einen Tropfen eiweißhaltige Lösung hängen von einem Deckglas. Darunter hängende Tropfen liegt ein Reservoir mit eine höhere Salzkonzentration als die des Tropfens. Im Laufe der Zeit Wasserdampf verlässt den Tropfen und landet im Stausee, verursacht das Protein zu kristallisieren. Jedes Protein erfordert unterschiedliche Bedingungen (z.B. Salzkonzentration und pH-Wert) und oft ausprobieren bietet die einzige Möglichkeit, die richtigen Bedingungen zu finden.

Anweisungen

• Setzen Sie auf Lab Gear (Mantel, Handschuhe und Auge-Schutz).

• Verwenden einer Mikropipette 1,1 mL einer Natrium-Chlorid (Salz) und Acetat-Pufferlösung in ein Eppendorf-Rohr hinzuzufügen.

• Etwa fünf Minuten bei 13.000 u/min zentrifugieren der geschlossenen Eppendorf Tube mit der Salzlösung drin. Denken Sie daran, die Zentrifuge auszugleichen, indem man eine andere Eppendorf-Rohr mit 1,1 mL Wasser über aus und gegenüber der Salzlösung-Röhre.

• Fügen Sie 1 mL der Salzlösung zu einem Brunnen in einer 24-Well-Platte.

• Verwenden Sie eine Spritze mit Fett gefüllt, um eine dünne Schicht aus Fett rund um die Felge von dieser gut platzieren. Achten Sie darauf nicht zu viel oder zu wenig hinzufügen. Wenn Sie zuviel Fett hinzufügen, wird das Fett nach unten in den Brunnen laufen und eventuell verderben Ihr Experiment. Wenn Sie zu wenig verwenden, wird der Brunnen nicht luftdicht sein und dein Experiment funktioniert nicht. Ziel für gerade genug Fett, dass das Deckglas und Fett später eine luftdichte Versiegelung bilden.

• Rollen Sie den Ton mit den Händen, vier kleine Kugeln zu machen, und schieben Sie sie auf den vier Ecken der 24-Well-Platte. Sie fungieren als Unterstützung um sicherzustellen, dass die Abdeckung der Platte nicht in Kontakt mit dem Deckglas kommt.

• Verwenden Sie Druckluft zum Blasen jeder aus dem Deckglas Staub. Halten Sie das Deckglas mit einer sauberen Pinzette.

• 4 Mikroliter der Lysozym-Lösung mit Ihrem Mikropipette saugen Sie auf, und fügen Sie diese Lösung in die Mitte des das Deckglas. Ändern Sie Pipettenspitzen zu, und fügen Sie 4 Mikroliter der Salz-Lösung. Sanft pipettiert oben und unten, in der Flüssigkeit saugen dann ordinierte es, um die Salzlösung mit Lysozym-Lösung zu mischen. Achten Sie darauf, die beiden ohne die Flüssigkeit überall auf das Deckglas Dispergieren mischen.

• Drehen Sie das Deckglas schnell so dass die Flüssigkeit nicht abrutschen und Pflanze es direkt oben auf dem Brunnen. Achten Sie darauf, um sanft drauf zu drücken, so dass es eine luftdichte Versiegelung mit dem Fett rund um die Kanten des Brunnens bildet.

• Schieben Sie die Abdeckung der 24-Well-Platte auf die Ton-Kugeln und lassen Sie die Platte an einem kühlen Ort.


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