Gewusst wie: Entwerfen Sie eine PCR-Primer

September 1

Laut der University of Wisconsin BioWeb Website ist eine PCR-Primer eine kurze, synthetische Oligonukleotid (in der Regel zwischen 18 bis 25 Basen) verwendet, um bestimmte Regionen von DNA in eine molekularbiologische Technik bekannt als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verstärken. Sowohl eine Forward- und reverse-Grundierung sind erforderlich, so konzipiert, dass umgekehrte Ergänzung von der DNA-Strang zu flankieren und binden Sie an die gewünschte DNA-Region. Wenn Wissenschaftler Forschung für ein spezifisches gen oder eine Region von DNA ausführen möchten, müssen sie zuerst PCR genug von der Zielregion mit Arbeiten zu gewinnen führen. Entwerfen Grundierung Sequenzen für die Region von Interesse ist möglicherweise erforderlich, wenn sie nicht bereits durch zuvor veröffentlichten Forschung oder durch kommerzielle Mittel verfügbar sind.

Anweisungen

• Abrufen der Nukleotidsequenz der Gene oder DNA Interessenbereich und entscheiden, wie lange eine Fragment, die Sie verstärken möchten. Die Forward- und reverse-Grundierung soll am Anfang und am Ende das gewünschte Fragment zu binden. In der Regel verwenden konventionelle PCR-Methoden Zündkapseln, die eine Region zwischen 100 bis 1.000 Basenpaare lang, flankieren, während Real-Time PCR Methoden Verwendung etwa 50 bis 200 Basenpaare lang Fragmente.

• Entscheiden Sie, in der Folge die Zündkapseln liegen soll. Beispielsweise sollten Sie die Lage in der Nähe der 5' oder 3'-Ende der Sequenz oder in der Mitte. Falls gewünscht, bestimmen Sie den Speicherort der Zündkapseln ein Intron überspannen.

• Führen Sie die empfohlenen Richtlinien für besser gekleideteres Design. Erfolgreiche Verstärkung von DNA Produkt hängt von der Qualität der Zündkapseln und bestimmte Variablen sind entscheidend.

• Entwerfen Sie Zündkapseln 18 bis 24 Basen lang sein. Vincent R. Prezioso, Ph.D. von Brinkmann Instruments Inc., legt nahe, dass diese Länge lang genug ist, um für die gewünschte DNA-Region sehr spezifisch sein, aber kurz genug zum Binden (Tempern) leicht. Grundierung, die Schmelztemperatur (Tm) sollte zwischen 55 bis 80 Grad Celsius, niedrig genug, um komplette ermöglichen schmelzen bei oder über 90 Grad Celsius, aber hoch genug, um das Glühen lassen. Der GC-Gehalt (Anteil der Gs und Cs in der Sequenz) sollte zwischen 40 und 60 Prozent liegen. Das 3'-Ende der Sequenz Grundierung sollte enden in ein C oder ein G (genannt Stativklemme GC) zur Förderung der Bindung, da die Nukleotide G und C stärkere Anleihen haben jedoch zu vermeiden, dass drei oder mehr Gs oder Cs in den letzten fünf Basen der Sequenz.

• Vermeiden Sie mit läuft von vier oder mehr über eine Base (wie ACCCC...) oder vier oder mehr di-Nukleotid wiederholt (wie ATATATAT...), da sie Mispriming verursachen können. Entwurf-Grundierungen ohne Intra-Grundierung Homologie (mehr als drei Basen, die innerhalb einer Grundierung selbst ergänzen) oder Inter Grundierung Homologie (wo die Forward- und reverse-Grundierung haben ergänzend zu Sequenzen). Dadurch können selbst-Dimere oder Zündkapseldimer, wo die Zündkapseln sich selbst anstatt Bindung an die gewünschte DNA-Sequenz binden.

• Verwenden Sie online-Ressourcen und Websites, die helfen, besser gekleideteres Design oder Kontrollkästchen Grundierung Sequenzen für selbst-Komplementarität oder Sekundärstrukturen wie Haarnadeln können helfen. Einige Grundierung Gestaltung Websites enthalten Massachusetts Institute of Technology Primer3, National Center for Biotechnology Information Primer-Blast und integrierte DNA-Technologien OligoAnalyzer.


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